IgY在体外和体内对幽门螺旋杆菌作用研究

 IgY技术     |      2021-03-17

“幽门螺旋杆菌(Hp)被确认为多种上消化道疾病的重要致病菌,是慢性胃炎和消化性溃疡的重要病因之一,与胃癌的发生密切相关”。


研究发现,Hp病株上的毒性蛋白“空泡素”在其中扮演一重要角色。若通过口服IgY抗体制剂来中和毒性蛋白即可获得有效治疗。


而且相比于传统以抗生素为主的治疗方案,IgY抗体疗法副作用小、不易产生耐药性,有望成为新一代临床治疗方案。


本实验即选取空泡素阳性的Hp菌株,制备抗Hp超声裂解物和Hp培养上清的IgY抗体,研究IgY抗体对Hp细胞毒性的中和作用和对感染Hp小鼠的治疗作用。


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简单实验思路

获取“空泡素阳性幽门螺旋杆菌”菌株的致病蛋白——抗原。


利用抗原刺激机体产生相应抗体的原理,获取抗体IgY。


通过“不加入Hp抗体”和“加入Hp抗体”对照分析 “Hp致病蛋白”对普通细胞的损伤程度以研究IgY抗体对Hp细胞毒性的中和作用。


取Hp感染小鼠,一组未服IgY,为对照组,其余口服抗体IgY,观察经治疗小鼠Hp的阴转率及其胃部病理切片,探究IgY对感染Hp小鼠的治疗作用。



      
具体实验分析


1、Hp菌株及培养鉴定


实验选取NCTC11637、SS1及4株临床患者分离而得的Hp菌株,培养基培养3天,经形态学及尿素酶检查,确认培养菌株为幽门螺旋杆菌而非其他杂菌,另行PCR鉴定所得菌株细胞空泡素基因阳性,确认菌株有致病能力,为接下来实验奠定基础。



2、Hp抗原制备


菌株分别行超声破碎获取菌体蛋白、超滤浓缩获取上清。后经SDS-PAGE法测量分离所得蛋白、上清纯度。结果如下:


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1:标准带    2:超声破碎菌体蛋白    3:超滤浓缩上清


结果显示:

超声破碎菌体蛋白主要有两条带:67000、60000

超滤浓缩上清主要有两条带:94000、67000


两种抗原(超声破碎菌体蛋白、超滤浓缩上清)纯度高,并且都有Mr=67000条带,与尿素酶Mr相近,意为本实验所获的两种抗原均含有幽门螺旋杆菌致病因子“尿素酶”。另“超滤浓缩上清”除主要条带还包含Mr=97000条带(如图所示)与空泡素蛋白Mr相近,同理,表明其上有Hp致病因子“空泡素”。



3、免疫及IgY制备


免疫:用上步所获的两种抗原(超声破碎菌体蛋白、超滤浓缩上清)皮下注射,诱导母鸡产生抗体IgG。ELISA法测效价,7天后效价达1:1600(表明鸡蛋卵黄含有足量的抗体IgY)即可开始收蛋,共收15天。吸取蛋中卵黄液,经水稀释法和两次硫酸铵沉淀法分离纯化抗体IgY,“超声破碎菌体蛋白”免疫制备IgY设为IgY1,“超滤浓缩上清” 免疫制备IgY设为IgY2,二者经SDS-PAGE法检测所获抗体纯度,ELISA法检测抗体效价,结果如下:       


SDS-PAGE:

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1:标准带       4:IgY1      5:IgY2


IgY1, IgY2主要条带均为68000和40000,表明二者纯度相近。


ELISA法测得效价:IgY1为1:3200, IgY2为1:6400,显示IgY2中抗体量相较更高。


以上为“材料准备”,明确所制的抗原抗体纯度、浓度均足够,为接下来 “研究IgY抗体对Hp细胞毒性的中和作用和对感染Hp小鼠的治疗作用”做准备。



4、Hp超声提取物及培养上清的Vero细胞毒性实验及IgY抗体中和细胞毒作用测定。


Vero细胞毒性实验:采用MTT法,将Vero细胞培养于96孔板中,次日在相应孔板滴入100ul不同浓度的超声破碎菌体蛋白或超滤浓缩上清,另设立一不加细胞和培养基、只加MTT的二甲基亚砜的孔为空白对照组,经各项操作后,测570nm吸光度(A)值和细胞存活率,结果如下:

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A570越小表明Vero细胞存活率越低即“Hp致病抗原”对细胞毒性损伤越大。


MTT测定结果显示:随两种抗原量10-40ug/ml逐步上升,抗原细胞毒性越大,Vero细胞活性越小。当超声抗原大于60ug/ml、培养上清大于40ug/ml时,细胞破碎、明显皱缩,其活性也明显下降。


综上即可表明此2种抗原对细胞均具有损伤效果。


IgY抗体中和细胞毒作用测定:取Hp菌体蛋白(抗原)60ug/ml,分别于IgY(10-320 ug/ml)按1:1比例混合,37℃ 2 h后取1.0ml上清加入Vero细胞中,同细胞毒性实验,测其测570nm吸光度(A)值和细胞存活率,结果如下:

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该实验结果表明:随IgY1 IgY2浓度的增加,Hp菌体蛋白(抗原)对细胞的损伤逐渐减小,Vero细胞存活率逐渐增高,提示所获取的IgY抗体很可能为空泡素及尿素酶的抗体,并且当这两种抗原浓度达到80-320 ug/ml时,细胞存活率均在90%以上,显示:其几乎可完全阻断Hp蛋白抗原对Vero细胞的毒性作用。另外二者的中和作用相差不多。



5、IgY抗体对感染Hp小鼠的治疗作用。


取Hp感染的BALB/c小鼠,分三组,每组11只。前两组分别口服IgY1 和IgY2 10mg,间隔1天,共三次。剩余一组未服IgY,喂前服3%NaHCO3 0.2ml,设为对照组。经2、4、6、8周后分批处死小鼠,提取胃黏膜,做细菌培养 ,尿素酶试验和病理检查。结果如下:

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表5显示:服用IgY1小鼠在2、4、6、8周后Hp阴转率达66.7%、100%、100%、100%,服用IgY2小鼠在2、4、6、8周后Hp阴转率达100%、66.7%、100%、100%,提示口服抗体IgY 两周后,抗体能够在体内中和Hp的蛋白毒素,根除或减轻Hp感染。


而图2,图3的胃部病理切片则显示:Hp导致的胃部炎症可在口服IgY抗体后明显减轻甚至消失。


综上,即可说明口服IgY抗体对感染Hp的小鼠有治疗作用。



      
实验结论

IgY抗体可以中和Hp毒素细胞毒性,减轻或根除Hp对细胞的损伤。此外口服IgY抗体2周后,Hp阴转率显著提高,4周后阴转率即可达到100%,更有病理切片表明口服IgY抗体后胃部细胞炎症明显减轻或消失。综上所述,人们可以通过口服IgY抗体制剂来中和幽门螺旋杆菌的毒性蛋白 以达到根除Hp感染的目的。




兰幽 全消化护胃队