幽门螺杆菌在我国病发率高达50%,与慢性胃炎、消化性溃疡等疾病息息相关。由于三联疗法和四联疗法易产生耐药性加之患者配合度不高等缺点,常导致抗Hp治疗失败。
现研究发现特异性鸡卵黄抗体IgY能够有效杀灭幽门螺旋杆菌,为Hp-IgY的开发和维护应用奠定基础,本实验即检测抗Hp-IgY的理化特性和生物学特性。
实验步骤及分析
制备抗体Hp-IgY
取Hp菌株NCTC11637、NCTC11639、SS1及22株临床分离菌株进行鉴定培养: PCR确定Hp、且vacA基因阳性 → 超生破碎法制备HP抗原 → 产蛋母鸡免疫、收蛋、水稀释硫酸铵沉淀法提取蛋中抗Hp-IgY,并用SDS-PAGE电泳法检测所获抗体纯度、浓度、活性回收率。
结果显示:
紫外分光光度仪测定提取物中蛋白质含量,发现每只免疫鸡蛋能产120mg IgY,且在初次免疫9天后Hp-IgY开始测出且持续升高,活性持续25周以上。
因此,IgY产量稀少,难得。而获取高质量的IgY更是难上加难。
ELISA法检测IgY抗体的热、酸碱、渗透压稳定性、酶稳定性及室温存储试验:设阳性对照:未处理的IgY稀释液,阴性对照:未免疫鸡卵黄提取物。
结果显示:
温度:
40°C以下抗Hp-IgY活性基本稳定
45°C时活性下降程度在10%以内
55-65 °C之间活性下降程度在20%以内
70 °C时活性下降达30%
80 ℃时仍有19%的活性
90 ℃时完全失去活性
如上所示,可知IgY抗体具有耐热特性。人体正常体温一般低于40℃,不超45℃。IgY在40℃以下活性基本稳定,45℃活性下降程度仅为10%以内,为IgY在人体胃中发挥功效提供先决条件。
因此,在使用IgY产品时,不要用超过40°的热水送服。
PH:
pH4~7,抗Hp-IgY的活性几乎不受影响
pH7~8,抗Hp-IgY的活性降低程度不超过10%
pH<4,抗Hp-IgY的活性急剧下降
pH=4,活性下降约70%
pH=3,活性下降约80%
pH=2,抗Hp-IgY接近失活。
正常人体胃液PH值<2,但该实验数据显示“pH=2,抗Hp-IgY接近失活。”提示:IgY抗体需结合抗酸药物使用,提升胃腔PH值至4-7,以保IgY活性,杀灭Hp。
因此,在使用IgY产品时,应在餐后服用,餐后胃液PH值可达到在4-5左右
渗透压稳定性:
随蔗糖浓度增高,抗Hp-IgY的活性缓慢下降;蔗糖浓度为50%时,抗Hp-IgY活性仍在90%以上。
表明蔗糖浓度对抗Hp-IgY活性的影响较小。
酶稳定性:
随pH值升高,胃蛋白酶对抗Hp-IgY活的影响逐渐减小:
pH=2,胃蛋白酶对抗Hp-IgY的活性影响最大
pH=6,胃蛋白酶对抗Hp-IgY的活性几乎无影响
实验结果同“PH”:在人体胃腔PH值为0.9-1.5前提下,因胃蛋白酶对其影响强大,所以需结合提升胃腔PH值的药物如抑酸药等方能发挥IgY功效,或在餐后半小时内尽快服用。
存储试验:
反复冻融5次时,仍有99%的活性
保存6个月时仍有95%以上的活性
表明:抗Hp-IgY的活性受冻融次数、保存时间几乎不受影响。
抗Hp-IgY抑制Hp生长实验表明抗Hp-IgY具有杀伤Hp作用
取2组同等浓度Hp,一组不做任何处理,另一组分别加入10、5、2.5mg/ml抗Hp-IgY,均至于37℃微氧环境中培养,采用比浊法记录12、24、36、48h Hp数量。
结果显示:
Hp在24 h内处于对数生长期,24h后进人平稳期。而Hp-IgY 对Hp生长的抑制强度和抑制时间随抗Hp-IgY浓度增大而增大。
表明抗Hp-IgY具有杀伤Hp作用。
实验结果分析
抗Hp-IgY确有杀灭幽门螺旋杆菌作用。正常人体体温下,其能保持正常活性,为后续作用发挥奠定基础。
此外,储存试验表明: 相比于哺乳动物抗体(不宜长时间保存,保存条件要求较高)抗Hp-IgY稳定性好、较周围环境而言:耐酸、耐热,且室温下保存数月中和细菌的能力仍无明显改变、反复冻融活性几乎不受影响。这些特点有效减轻了抗Hp-IgY的存储压力。